На правах рукописи

САДОВНИКОВ СЕРГЕЙ ВАЛЕНТИНОВИЧ БИОСИНТЕЗ ТИРОЗИНГИДРОКСИЛАЗЫ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РЕГУЛИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЛАДАСТЕНА 03.00.04 - биохимия 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2007

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Научные руководители: кандидат биологических наук, Вахитова Юлия Венеровна доктор медицинских наук, Вальдман Елена Артуровна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Островская Рита Ушеровна доктор биологических наук, профессор Мустафина Ольга Евгеньевна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится У Ф ноября 2007г. в часов на заседании Диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, по адресу: 450054, Уфа, ул. Проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан: У У октября 2007г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, к.б.н Бикбулатова С.М.

2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современной клинической практике широко используется ряд адамантан-содержащих лекарственных препаратов, обладающих противопаркинсонической (амантадин, мемантин) [Sсhawab et al., 1969; Rabey et al., 1992], противовирусной (ремантадин, адапромин) [Першин и соавт., 1973;

Букринская, 1988], ноотропной (адафеноксат) [Petkov et al., 1988], иммуностимулирующей (кемантан) [Арцимович и соавт., 1990], миорелаксантной (диадоний) [Харкевич и соавт., 1974], противоопухолевой (ДАМП) [Ho et al., 1972] активностью. Однако, у многих производных адамантана, помимо основных эффектов, обнаружены нейропсихотропные свойства активирующего типа, обусловленные, как полагают, специфическим дофамин- и серотонинпозитивным действием, а также тропностью к рецепторам возбуждающих аминокислот [Морозов и др., 2001]. Эти вещества обладают низкой токсичностью, не вызывают эйфории, толерантности и зависимости [Вальдман и соавт., 1976]. Еще одним общим свойством этих соединений является их высокая мембранотропность, связанная с липофильностью адамантанового ядра, и в значительной степени определяющая особенности фармакокинетики и фармакодинамики адамантановых производных [Ковалев, 1977]. В ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН на протяжении ряда лет проводился целенаправленный поиск новых эффективных средств психоактивирующего действия на основе производных адамантана [Морозов и соавт., 1999]. В результате скрининговых исследований по анализу совокупности фармакологических свойств и выраженности психоактивирующих эффектов было отобрано соединение АДК-709 - N-(2-адамантил)-N-парабромфениламин. После обнаружения в спектре действия препарата анксиолитических свойств соединение получило название ладастен [Середенин и соавт., 2001]. К настоящему времени фармакологическая активность ладастена и некоторые аспекты механизмов его действия достаточно подробно изучены и охарактеризованы. Это позволило рекомендовать препарат для клинических исследований в качестве антиастенического средства при психогенных астенических расстройствах [Сюняков и соавт., 2006].

Как уже отмечалось выше, первоначально ладастен разрабатывался в качестве средства повышения адаптации и работоспособности в экстремальных условиях, включающих интенсивные физические и эмоционально-психические нагрузки.

Традиционно с этой целью использовались психостимуляторы - производные и структурные аналоги фенилалкиламинов, сиднониминов, а также антигипоксанты, транквилизаторы, ноотропы, адаптогены и вещества метаболического типа действия [Бобков и соавт., 1984]. В то же время, экспериментальные психофармакологические исследования позволили выявить целый ряд преимуществ ладастена перед классическими психостимуляторами. Следует отметить, что в доступной нам литературе данные о лекарственных веществах - производных аминоадамантана - с подобным спектром действия не обнаружены, что определяет необходимость изучения механизмов действия ладастена. Поскольку ранее использованные нейрохимические методы не позволяли придти к заключениям о том, как реализуются его эффекты, главным образом психостимулирующие, в настоящей работе в качестве концептуального избран подход оценки динамики функционального состояния потенциальной фармакологической мишени ладастена - ключевого фермента биосинтеза катехоламинов - тирозингидроксилазы. Подробное изучение нейрохимического профиля ладастена, механизмов его дофаминпозитивного действия в процессе реализации эффектов препарата позволяет углубить представления о фармакологических мишенях ладастена и открывает перспективы создания на его основе новых, более эффективных препаратов.

Цель исследования. Выявление основных механизмов регуляции биосинтеза ключевого фермента синтеза катехоламинов тирозингидроксилазы (ТГ) в клетках различных структур головного мозга крыс при однократном введении ладастена.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо были поставлены следующие задачи:

- исследовать влияние однократного введения ладастена (50 мг/кг, in vivo) на уровень L-ДОФА и дофамина в различных структурах мозга крыс;

- изучить динамику экспрессии гена и белка тирозингидроксилазы, а также уровня фермента, фосфорилированного по Ser40 (рТГ-Ser40) в вентральной области покрышки, прилежащем ядре, гипоталамусе, стриатуме, и гиппокампе головного мозга крыс в зависимости от продолжительности действия препарата (50 мг/кг, in vivo);

- изучить действие однократного введения ладастена (50 мг/кг, in vivo) на характер метилирования CpG-динуклеотидов промоторной области гена тирозингидроксилазы, экспрессирующегося в гипоталамусе крыс;

- исследовать эффект ладастена (однократно, 50 мг/кг, in vivo) на динамику уровня гистондеацетилазы 1 (HDAC1), а также содержание ацетилированных форм Н3 и Нгистонов (ацетил-Н3, ацетил-Н4) в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе крыс.

Научная новизна. Впервые показано, что ладастен при однократном внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг увеличивает экспрессию гена тирозингидроксилазы и содержание соответствующего белка, коррелирующее с накоплением продуктов реакции - L-ДОФА и дофамина в гипоталамусе, гиппокампе и вентральной области покрышки экспериментальных животных. Синтез de novo данного катехоламина под действием ладастена рассматривается в качестве основного механизма, определяющего особенности психоактивирующего действия препарата. Впервые показано, что изменение транскрипционной активности гена тирозингидроксилазы в клетках гипоталамуса крыс под действием ладастена может быть связано с изменением характера метилирования СрG-динуклеотидов в промоторной его области: выявлено увеличение частоты деметилирования СрGдинуклеотидов в последовательностях, ассоциированных с сайтами связывания отдельных транскрипционных факторов. Установлено, что ладастен снижает уровень гистондеацетилазы 1 в стриатуме и гиппокампе крыс, а также влияет на содержание ацетилированных форм гистонов Н3 и Н4 в различных структурах мозга крыс.

Научно-практическая значимость. Установленные геномные и внутриклеточные механизмы действия ладастена подтверждают данные о спектрах фармакологической активности препарата, что определяет целесообразность его использования в клинике при необходимости коррекции ряда состояний. Полученные данные учтены при составлении инструкции по применению ладастена в качестве антиастенического средства.

Внедрение результатов исследования в практику. Методические подходы, использованные в данной работе, могут найти применение на этапах доклинического исследования потенциальных лекарственных препаратов с целью уточнения спектра действия и анализа механизмов их активностей. Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций студентам на кафедре генетики Башкирского государственного педагогического университета.

Основные положения, выносимые на защиту. Предметом защиты данной работы являются следующие основные результаты исследований:

- одним из механизмов, обеспечивающим особенности психоактивирующего действия ладастена является усиление экспрессии гена и белка тирозингидроксилазы и биосинтеза дофамина в отдельных структурах мозга крыс;

- в регуляцию транскрипционной активности данного гена вовлекаются эпигенетические механизмы, что проявляется в увеличении частоты деметилирования цитозинов в сайтах связывания отдельных транскрипционных факторов в промоторной области гена тирозингидроксилазы;

- ладастен ингибирует активность гистондеацетилазы 1 и влияет на содержание ацетилированных форм гистонов Н3 и Н4.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами Программы фундаментальных исследований Президиума РАН УМолекулярная и клеточная биологияФ (10002-251/П-10/142-448/260503-196), Государственной поддержки ведущих научных школ РФ (НШ - 2217.2003.4), РФФИ - Агидель (02-0497904), Программы целевых расходов Президиума РАН УПоддержка молодых ученыхФ (10324-812).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на V-м Съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); 4-й Международной конференции УБиологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствамФ (Москва, 2006); Научно-практической конференции УНовая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)Ф (Ростов-на-Дону, 2006), III Съезде Фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007). Работа апробирована на заседании Ученого совета Института биохимии и генетики (протокол № 14 от 2 октября 2007 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 3 таблицы и 20 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (главы 3 и 4), заключения, выводов и списка литературы, включающего 227 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах половозрелого возраста, массой 200-250 г. Во всех опытах использовали две группы животных - контрольную и опытную - по 5-6 крыс в каждой. Ладастен вводили внутрь при помощи зонда в виде суспензии с добавлением Tween 80, контрольным животным - физиологический раствор с добавлением Tween 80. Доза ладастена (опытнотехнологический отдел ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН) 50 мг/кг.

Все манипуляции с животными проводили в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (1977). Декапитацию крыс проводили после однократного введения препарата через 15 мин, 0.5 ч, 1 ч, 1.5 ч, 2 ч, 2.5 ч. Сразу после декапитации извлекали головной мозг, и в зависимости от целей исследования использовали в экспериментах либо целый головной мозг, либо выделяли структуры головного мозга (стриатум, гипоталамус, гиппокамп, вентральную область покрышки, прилежащее ядро) (Glowinski и Iversen, 1966). Ткани замораживали в жидком азоте и хранили при -70С.

Суммарные препараты ДНК из структур головного мозга получали с использованием стандартной методики, включающей в себя инкубацию с протеиназой К и последующей фенольно-хлороформной очисткой (Sambrook et al., 2001). Бисульфитную модификацию ДНК проводили по методу Olek et al.

(1996). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартному протоколу с использованием Taq ДНК-полимеразы (MBI Fermentas, CША).

Модифицированные бисульфитом натрия образцы ДНК амплифицировали с двумя парами праймеров (методом ПЦР). Подбор праймеров к исследуемому фрагменту гена тирозингидроксилазы осуществляли с помощью программы MethPrimer v.1.1 b (последовательности AF069036 EMBL; X04914 GenBank). Аналитический и препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях, элюцию ДНК из агарозных гелей, подготовку компетентных клеток и их трансформацию проводили в соответствии с (Sambrook et al., 2001). Клонирование элюированных из геля продуктов ПЦР проводили с помощью набора УpGEM-T and pGEM-T Easy Vector SystemsФ (Promega, США) по методике фирмы - изготовителя. Выделение и очистку плазмидной ДНК осуществляли УWizardо Plus Minipreps DNA Purification SystemФ(Promega, США). Реакцию автоматического прямого секвенирования проводили на приборе ABI Prism 310 c использованием набора УBigDyeЩ Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready ReactionФ (Applied Biosystems, Великобритания) по протоколам производителя. Результаты секвенирования обрабатывали с использованием программы Chromas 3.01. Очистку продукта ПЦР для секвенирования проводили согласно протоколу УWizardоSV Gel and PCR Clean-Up SystemФ (Promega, США).

Суммарную РНК выделяли с использованием "TRIzol Reagent" (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Примеси ДНК удаляли с помощью ДНКазы I (Promega, США) c последующей очисткой смесью фенолхлороформ. Реакцию обратной транскрипции РНК проводили с использованием oligo(dT)12-18-праймера (Invitrogene, США) и обратной транскриптазы M-MuLV (MBI Fermentas, США) в термоциклере ДТерцикФ (УДНК-ТехнологияФ, Россия).

Анализ экспрессии гена тирозингидроксилазы проводили методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени на приборе "iCycler iQTM RealTime PCR Detection System" (BioRad, США) c использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I и программного обеспечения "iCycler iQ Real-Time Detection System software" версия 3.0.6070 (BioRad, США). Праймеры к нуклеотидным последовательностям анализируемого гена подбирали с помощью программы Primer 3 (www_genome.wi.mit.edu/cgi.bin/primer/primer3www.cgi) с последующим анализом в программах "DNAStar" ("LaserGene") и ОLIGO 6.0. Изменения в уровнях экспрессии гена ТГ рассчитывали с использованием значений пороговых циклов с помощью специализированной программы REST Tool V1.9.9 (Corbertt Research, CША), обладающей возможностью статистической обработки данных (Pfaffl et al., 2002).

Выделение цитоплазматических и гистоновых белков проводили по методам, описанным в (Hjelmand, 1990). Концентрацию белков оценивали спектрофотометрически (спектрофотометр УSmartSpecЩ PlusФ, BioRad, США) по методу Bradford (1976), используя бычий сывороточный альбумин фракция V в качестве стандарта.